薄层扫描法 09中药一班 薄层扫描法 ? 一、定义 ? 薄层扫描法(TLCS)又称原位定量薄层色谱 扫描法(QTLC)系指用一定的波长的光照 射在薄层板上,对薄层色谱中有紫外或可 见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光斑 点进行扫描,将扫描得到的图谱及积分值 用于药品定性定量的分析方法。 回顾薄层色谱法(TLC) ? 1、薄层板的制备(硅胶板,Al O3板,聚酰 胺薄膜等) ? 2、点样(选择合适的展开剂,在薄板底 1cm处画基线、展开(浸入展开剂,展开到距薄板顶端 1~2cm) ? 4、检视(在紫外光灯下观察斑点) 2 了解一下薄层扫描仪 ? 薄层扫描仪的组成及主要功能 薄层色谱扫描仪有多个厂家生产,型号不同,仪器外 形、光路系统及某些功能也有差异,但其基本结构及主要 功能是基本相同的。每台仪器都包括主机、数据处理及信 号输出等部分。 (1)分光器及测量范围 大多数薄层扫描仪的分光器为光栅,少数为棱镜,极 个别的用滤光片,其测量范围光栅为200-800nm,棱镜 为200-2500nm。 (2)光源及检测器 光源室具有可见光源钨灯,波长范围为400-800,紫外 光源氘灯波长范围为200-400nm,荧光光源为氙灯或汞 灯。操作时可通过光源选择杆来变换光源选择镜的位置; 检测器一般为光电倍增管。 表7-5-2 国外几种主要专用薄层色谱 扫描仪 二、TLCS基本原理与方法 ? 薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。 ? 1. 薄层吸收扫描法的基本原理 ? 薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射 展开后的薄层色谱板,测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸 光度(A)随展开压离(L)的变化,而获得A—L成A—Rf曲线, 即薄层色谱扫描图(简称扫描图)。 ? 曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层 板存在着明显的散射现象,而使斑点中物质的浓度与吸光 度的关系不服从Beer定律,所以需田Kubelka—Munk(古 柏尔卡—曼克)理论来描述。该方程式是薄层扫描法的定 量分析基础。定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回 归法等。 ? 设薄板固定相的厚度为X, 入射光的强度为I.,当透过 厚度x的的固定相后,照 射在微分薄层厚度dx上的 入射光强与反射光强分别 为i和j时,如左图。其入 射光强的增量与反射光强 的增量分别符合以下两个 微分方程: ? 即光照射到厚度为x的薄层后,光被吸收及散射。 在入射方向,光强度因为被吸收与散射而减弱; 在入射的反方向,则光强度因散射而增强。解上 述方程得: ? 在薄层扫描时,人们只是对进入薄层和由薄层出来的光有 兴趣,也即上式的极端情况,x=0及x=X时 对比两图很易发现,由于薄层固定相的散射作用使在透射法中 所测得的斑点的吸光度产生正偏差,而在反射法测定时产生负 偏差。这是因为照射光被散射,降低了透射率,吸光度增加; 散射光增加了反射光光强,增加了反射率,而降低了吸光度的 缘故。其次,还可发现后图比前图的横座标大25倍,这说明了 反射法的灵敏度(响应值)比透过法小。 1· Kubelka-Munk曲线 Kubelka-Munk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其 浓度间呈非线性关系,该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理 论依据。曲线处理采用两类方法:曲线校直法及计算机回归法 (线性及非线性回归)。CS系列仪器采用前者,CAMAG仪器采 用后者方法。 曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值,将Kubelka -Munk曲线校正为直线,简化A与KX间的关系,以利于定量 分析。 用曲线校正法校直Kubelka—Munk曲线,必须巳知薄层板的 SX值,Mrck预制硅胶板的SX=3,Merck预制氧化铝板的 SX=7,Wako预制硅胶FM(硅胶GF254)板的SX=7。国产 预制薄层板及自制薄层板,可参考上述数据试调,而后检查 校正是否适宜,修正SX值再校,直至A—KX曲线成直线为止。 检查方法如下图所示。图中点样量显(横坐标)常用单位为ug/ 点。 ? 应用时应注意: ? 曲线校直法是一种简便的薄层扫描定 量校准方法,但比较粗糙,且有时难于准 确知道薄层板的SX值。为了降低定量误差, 应使标准品的色谱峰峰面积与待测品(供试 品)的色谱峰面积尽量接近为好。 ? 2. 薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择 ? 薄层吸收扫描法的扫描条件,包括扫描方式、波长及 测光方式等。扫描方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波 长的选择至关重要,不仅关系检测灵敏度,而且关系干扰 的排除等。测光方式分为透射式及反射式 ? 2.1 扫描方式选择 ? (1) 直线扫描 ? 直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端,而后 作直线运动至另—端。在作直线式扫描时,实际上是光带 固定,薄层板相对于光带作直线运动。 在作直线扫描时,光带的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积影 响很大,下图说明了光带越长,所得的色谱蜂面积越小,反之 则峰面积越大。光带太长,检测灵敏度低,光带太短,光带只 通过斑点的一部分,所得的蜂面积,不能真实反砍斑点的吸收 情况。因此,正常扫描时,应使光带长度略大于斑点直径。在 多斑点扫描的,光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量 误差,应使标准品斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。样 品斑点为带状时,光带长度应约为样带的2/3。 不规则斑点,用直线式扫描定量,即使光带长度适 宜,定量误差仍然较大,因为所得峰面积还与扫描 方向有关。 综上所述,直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条 状薄层色谱斑点的定量分析。所能测定斑点的大小,以仪器 的光带长度为上限。例CS—930薄层扫描仪,出射狭缝最大 长度(高度)为6mm,只能测定小于6mm的斑点。 在作直 线式扫描叫,光带的步进距离ΔY也影响蜂面积。斑点小应选 小步进距离,选择适宜,能降低定量误差。有关TLC及 HPTLC板的光带长度及步进距离的具体选择见表。 (2)锯齿式扫描 用截面积为正方形的光束照射薄层板,光束的 运动轨迹为矩齿形。CS系列的摆动距阂最大为 30mm,因此锯齿式扫描适用于直径小于30mm的斑 点。 直线式扫在做锯齿形扫描时,由于光束来回通过斑点,吸光度 积分值比描大,重复性较好。 锯齿扫描还适用于不规则斑点的定量。虽然扫描方向不同时, 所得的色谱峰形状有差别,但积分值差别较小。 机械锯齿式描仪器扫描速度慢是其缺点,飞点扫描型仪器(如 CS-9000型薄层扫描仪)则克服了此缺点。 2.2 波长选择 波长选择适宜不仅可以提高灵教度,在双波长法印还可 排除干扰并可使基线平直,因而波长选择关系重大。单波长与 双波长法的波长选择分述如下。 (1)单波长薄层扫描法 用一种波长的单色光进行薄层扫描的方法称为单波长薄层 扫描法,简称单波长法。用单波长法所得的薄层色诺扫描图是 A-Rf或A-L曲线。通常选λmax为测量波长,以增加检测灵 敏度。单波长法较适用于 分离度较好,无背景干扰的薄层色谱的扫描,否则基线)双波长薄层扫描法 用两种波长的单色光交替照射薄层板,测定斑点对两种波 长的单色光的吸光度之差称双波长薄层扫描法,简称双波长法。 所得的薄层色谱扫描图是ΔA-Rf或ΔA-L曲线) 双校长法的优点 a.可以排除分离度不佳的两个斑点间的相互干扰, 能用于分离度不佳以至于完全重叠斑点的定量分析。 b.可以排除背景污染的干扰,使基线平直。 c.可以提高灵敏度。 d.可以改变色谱峰的倒正。 这些优点的实现,主要取决于波长对的选择。 3· 定量分析方法 ? TLCS最常用的定量方法是外标法,包括外标一点法和外 标二点法。 ? 1 外标一点法 ? 标准曲线通过原点(截距为零)时可用外标一点法定量。 即只需一种浓度的对照品溶液,与供试液同板展开,分别 测定其峰面积A,即C待=A标C标/A待 ? 2 外标二点法 ? 该法是TLCS法中主要的定量分析方法。标准曲线不通过 或一种浓度原点时只能用该法定量,至少需点两种不同浓 度两种点样量的对照品溶液,与供试液同板展开,分别测 定其峰面积A,用对照品求直线方程:A=Km+B,代入即得。 照稀液残浸 干乙 定测 进同斑酸( 胶 ,定 行样点乙 板及 品释,渣泡 ,醚 品 薄大显醇 上对的适至微加次 残适烘洗加法 照溶量刻热适, 渣量干涤水: 层小色溶 ,品 ,度使量 用, , 取 , 扫的清液 以 液精,溶无每 石加, 在 重 溶 )计 描玻晰,) 环液。密摇解水次 油热连室,量 计算 ,璃,在展 己 作称匀,乙 醚回同温放差 开烷 为 即 波板取 , 与 定,定醇( (流滤干置异 三 对,作量三浸 提纸燥使项 得 长,出 取 氯 照加为转氯泡 取一至溶的 并松散 本 周, 出 甲,溶无供移甲 至软,本 品 分 围在加, 烷分液水试至 , 品 晾 每别 ,乙液 烷 )提索的滤 () 用薄热干 乙别精 丸测 交 醇。 取氏粉过, 含 量 胶层 , 酸叉密制另容:, 液提末, 山 布板 喷 乙点吸成取量 倾 回取状药剪 楂 供 固上 以 酯于取每熊瓶)去 收器,渣碎 以 试 定覆, 甲同供 果内混石 乙内在再, %酸一试 酸,合油 醚, 用精 熊品 果 与 ,盖至硫 硅液含对并溶醚 至加 水密 , 称 酸对 (照 ? ? 例 λs=535nm,λR=650nm, A . 0.5mg 6ul G 20:5:8:0.1 10ml 100℃ 1 C30H48O3 2 山 楂 含化 量滞 测丸 定中 熊 果 酸 的 10ml 4h 30~60℃ 5ml 2min 3 2 5ml 4ul 8ul 110℃ 5~7min - 3g 10 1ml ? 1、 取本品3g,剪碎,精 称 索氏提取 100℃ 烘干 法 +适量 例1 山楂化滞丸中熊果酸的含量测定 +H O +H2O 10ml 溶解, 10ml洗 滤过 涤,干 燥 2 至松软 粉末状 加热回流 4h 残 渣 +适量无水乙醇-三氯甲 烷(3:2)混合溶液 溶解,转移 定容至5ml 石油醚(30~60℃) 残渣 浸泡2次, 5ml/次 供试液 对照品溶 液 2、另取 熊果酸对照 品适量,精 称 +无水 乙醇 制成 0.5mg/ml 溶液 3、精吸供试液6ul及对照品溶液4ul与8ul,分别交叉点于同一硅胶G板上, 以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20:5:8:0.1)展开,取出,晾干,喷以10 %硫酸乙醇溶液,在110℃加热5~7min,至斑点显色清晰,取出,在薄层板 上覆盖同样大小的玻璃板,周围用胶布固定,进行薄层扫描,波长波长 λs=535nm,λR=650nm,分别测量供试品与对照品A,计算即得.本品每丸含山 楂以熊果酸(C30H48O3)计 ? 分析:本题采取双波长扫 描法,用外标二点法进行定 量计算。得到△A与浓度C 的线性关系代入即得。 熊果酸高含量为有光泽的棱柱状(无 水乙醇)或细毛样针状结晶(稀乙醇),低 含量为棕黄色或黄绿色粉末,具特殊的 气味,是存在于天然植物中的一种五环 三萜类化合物。熔点283~288℃. 比 旋光度[α]D25 +67.5°(C=1, 1mol/L氢氧化钾醇溶液中)。在15℃ 时,乙醇(99%)1毫升可溶解10毫克, 沸腾1毫升可溶解45毫克。尚易溶于甲 醇,丙酮,吡啶,不溶于水和石油醚 例2香连丸中盐酸小檗碱的含量测定 ? 测定法:取本品适量,研细,取约0.2g,精密称定,置索氏提取器中, 加盐酸-甲醇(1:100)的混合液适量,加热回流提取至提取液无色, 将提取液移至100ml量瓶中,用少量上述混合液洗涤容器,洗液并入 同一量瓶中,加上述混合液至刻度,摇匀,精密量取10ml,置50ml 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试液。另取盐酸小檗碱对照品 适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含20ug的溶液,作为对照品溶液。 精密吸取供试液4ul、对照液2ul与6ul,分别交叉点于同一硅胶G板上, 以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水(4:2:1:1:0.2)为展开剂,在 另一槽中加等体积的浓氨试液,预饱和15min后,展开,展距约 10cm,取出,晾干,进行荧光扫描,激发波长:λ=366nm,测供试 品荧光强度与对照品荧光强度的积分值,计算即得。本品每1含黄连 以盐酸小檗碱(C20H18ClNO4)计。 例2香连丸中盐酸小檗碱的含量测定 1、取研细本品约0.2g, 精称 置索氏提取器 +盐酸-甲醇 (1:100) 的混合液 加热回流至 提取液无色 转移至 100ml 量瓶 用混合液洗 涤容器并入 精取10ml与 +甲醇至 供试液 量瓶,至刻 50ml量瓶 刻度 度 2、另取盐酸小 +甲醇 制成 对照品溶液 20ug/ml溶 檗碱对照品适量, 液 精称 ?3、精密吸取供试液4ul、对照液2ul与6ul,分别交叉点于同一硅胶G 板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水(4:2:1:1:0.2)为展开剂, 在另一槽中加等体积的浓氨试液,预饱和15min后,展开,展距约 10cm,取出,晾干,进行荧光扫描,激发波长:λ=366nm,测供试品 荧光强度与对照品荧光强度的积分值,计算即得。本品每1含黄连以盐 酸小檗碱(C20H18ClNO4)计。 ? 分析:本题采取荧光扫描 法,同样采用外标二点法。 得到荧光强度I与浓度C的 线性关系,代入即得。 盐酸小檗碱是一种异喹啉生物碱。分 子式[C20H18NO4]+。又称黄连素 。存 在于小檗科等4科10属的许多植物中。 小檗碱从 中可析出黄色针状晶体。 熔点145℃。溶于水,难溶于苯、 和氯仿。

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