薄层色谱扫描法_医药卫生_专业资料。薄层色谱扫描法 中药二室 一、薄层色谱扫描法简介 二、影响薄层扫描定量的因素 三、介绍CAMAG薄层扫描仪 一、薄层色谱扫描法简介 1、简述 薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、 一定强度的

  薄层色谱扫描法 中药二室 一、薄层色谱扫描法简介 二、影响薄层扫描定量的因素 三、介绍CAMAG薄层扫描仪 一、薄层色谱扫描法简介 1、简述 薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、 一定强度的紫外或可见光对薄层板进行 扫描,测定薄层板上的样品斑点对光的 吸收强度或斑点经激发后产生的荧光强 度。所得到的图谱及积分数据可用于药 品的鉴别、检查及含量测定。 中药材:山豆根、槲寄生、女贞子、牛 黄、两面针、黄连等; 中成药:六味地黄丸(浓缩丸)、元胡 止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、 九分散等; 2、检测方法 (1)吸收法:扫描时测定薄层板上的样品斑点 对光吸收强度的方法。 (2)荧光法:测定样品斑点经激发后产生的荧 光强度的方法。 (3)荧光淬灭法:利用某些化合物减弱吸附剂 中荧光剂的紫外吸收强度而进行定量的方 法。由于薄层板各部分荧光强度不均匀,对 定量不太适用,而是便于斑点的定位。 3、测量方式 (1)透射法:测定照射光穿透样品斑点后 光的吸收情况。 (2)反射法:样品斑点对照射光的反射情 况进行测定的方法。 4、测光形式 (1)单波长扫描:使用一种波长的光束对薄层进行扫 描。适用于分离度好,背景干扰小的薄层色谱。 (2)双波长扫描:用测定波长和参比波长分别扫描薄 层后,测定样品斑点在两波长下的吸收度之差,可 减少分离度欠佳的组分间的相互干扰,并减少薄层 板的背景干扰,能显著改善基线的平稳性。操作时 应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比 波长。 5、扫描方式 (1)线性扫描:用一束比待测斑点略宽的狭窄 光带沿展开方向做单向等速扫描。适于形状 较规则斑点的扫描。在进行荧光测定时一般 只用线)锯齿扫描:使用微小正方形光束沿展开方 向扫描的同时,在垂直于展开方向进行往复 式扫描,扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿 形或矩形,它对于形状不规则或分布不均匀 的斑点扫描重复性较好,但扫描速度较慢。 6、定量方法 (1)外标法:如果标准曲线经过原点,可用一点法校正;如 果不通过原点,采用二点法校正,必要时用多点校正法。测 定时,供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上, 每份供试品溶液点样不得少于2个,对照品每一浓度不得少 于2个,其计算结果的相对平均偏差不得大于5%。计算公式: C=kA+b (kA+b)×稀释倍数 点样量×称样量 (2)内标法:将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以峰面 积的比值为定量依据.由于内标物的选择比较困难,目前应 用较少。 内标物:a.在样品溶液中加入一种在样品溶液中不存在的, b.性质与被测物质类似且又与样品中被测成分得 易分离的纯化物, 7、系统适用性试验 (1)检测灵敏度:指用于限量检查时,被测成分能 被检出的最低量。 (2)分离度:用于限量检查或含量测定时,要求定 量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。 (3)重复性:指同一薄层板上同一供试品溶液相同 浓度的数个斑点,扫描结果的偏差。不显色直接扫 描,相对标准偏差应不大于3.0%,显色后扫描,相 对标准偏差应不大于5.0%。 二、影响薄层扫描定量的因素 (一)吸附剂性能及薄层质量 1、吸附剂: (1)吸附剂颗粒大小,分布均匀程度能影响分离度 和检出限度。小颗粒且分布均匀的吸附剂,分离度 好,灵敏度高。 (2)吸附剂的含水量影响薄层活度,如果大气湿度 过大,吸附剂含水量过高,导致薄层活度过低,就 会影响分离效果,所以在点样前薄层板应进行活化 在110℃干燥30分钟。 (一)吸附剂性能及薄层质量 2、薄层:薄层厚度会影响定量结果,厚度下 降,展开后斑点扩散较严重,影响定量结果。 用透射法测定时,峰面积值随薄层厚度下降 而减小,用反射法测定,峰面积值随薄层厚 度下降而增加。 因此对吸附剂及薄层性能的规格化是薄层 色谱重现性及定量准确性的先决条件。 薄层板的种类 ? ? ? ? ? 硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、氧化铝板。 硅胶G板以石膏作为黏合剂; 硅胶GF254板是添加荧光指示剂;常用的荧光指示 剂有两种:一种是锰激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn), 在254nm波长下能发出荧光;另一种是银激活的硫 化锌、硫化镉(ZnS.CdS:Ag),在366nm波长下能 发出荧光。我们常用的是硅胶GF254板。 硅胶H板是没有外加黏合剂。 氧化铝板以氧化铝作为固定相,可以分离萜类, 生物碱类,脂肪族及芳香族化合物。 (二)点样 1 、一般为圆点状或窄细的条带状; 点样基线mm; 圆点状直径一般不大于3mm; 条带宽度一般为5-10mm; 点间距离不少于8mm。 2 、点样是薄层色谱的第一步,也是关键的一步,它既关系到 能否得到可以重现的薄层色谱,也关系到定量测定结果的准 确与否,点样量不宜过大,最好控制在10μ l以下,点样过多或 原点“超载”,展开剂产生“绕行”现象,使斑点拖尾或重叠, 致使扫描峰形不对称,或达不到基线分离。 (三)展开 1、预饱和 薄层各个部分对展开剂蒸气的预吸附程度不同,会影响色 谱分离,因此当用展开剂时,先将薄层及展开缸进行预饱和, 以便得到重现的色谱图。 2、相对湿度:50%-60%较适宜 相对湿度过大影响薄层活度,吸附剂吸附能力下降,分离 效果不理想。 3、温度:一般18-25℃较适宜 温度变化会影响组分在两相间的分配,被分离物质的Rf值 应在0.2-0.8较适合,Rf值太大,斑点易扩散,扫描重现差,Rf 值太小,斑点没有完全展开,扫描结果不能代表线 、边缘效应:同一化合物,在同一块薄层板上,用同一混 合展开剂,在同一展开槽内展开后,薄层中间部分的斑点比 薄层两侧边缘处的斑点的Rf值小。 用展开剂将展开缸及薄层板饱和后再进行展开就可以消 除边缘效应,饱和时间的长短因展开剂极性以及比例不同而 异。 5、展开剂 (1)展开剂过多次数的重复使用,也会影响Rf值的稳定。多 次使用展开剂时,实际上每一次的展开剂的组成,由于挥发、 吸附等原因已有改变。最好是临用新配,这样每次展开剂少 量、定量使用,以足够展层一次的用量为宜。 (2)每一种溶剂在展开中都有其一定的作用: a.展开剂中比例较大的溶剂起溶解物质和基本分离 的作用,极性相对较小: b.展开剂中比例较小的溶剂,极性较大,对被分离物 质有较强的洗脱力,帮助化合物在薄层上移动, 可以增大Rf值,但不能提高分辨率; c.展开剂中加入少量酸、碱可抑制某些化合物的斑 点拖尾;比如:六味地黄丸测定山茱萸中的熊果 酸,展开剂是:环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸(20: 5:8:0.1) d.展开剂中加入丙酮等中等极性溶剂可使不相混合 的溶剂混溶,并可以降低展开粘度,加快展速。 6、展距:一般为8-15cm 在这种展距内得不到分离的组分,增加展距并非 解决问题的办法,不仅延长了分离的时间,而且会引 起斑点扩散反而降低分离度,因此,展距内分离不理 想时,不能一味的增加展距,而是可以优化展开剂,以 得到理想的结果。 由此可见,展开时必须控制条件一致,得到重现的 分辨率最佳的色谱,才能得到可靠的定性定量结果。 (四)显色 显色剂必须与样品定量反应,且灵敏度要高,专属性要强, 色点稳定性好。 常用的是喷雾法显色,分为自动喷雾、手动喷雾。自动喷雾 的雾滴均匀而细,比手动喷雾得到的背景吸收小,重现性及定 量准确度高。需注意的是:喷完显色剂后,需加热显色的,应 注意控制加热的温度和时间,尤其含羧甲基纤维素钠的薄层 板,温度过高或加热时间过长易焦化,如果用硫酸等显色剂 可使板面炭化而影响显色效果;加热时间不够,导致斑点未 显出或显色不完全;有的成分加热的温度和加热的时间不同. 显色效果是有差别的。 将显色的薄层板避光保存,以同样大小的玻璃板覆盖并密 封,可增加色斑的稳定性。 (五)薄层扫描定量 (1)色谱条件不优化,操作技术不规范得到的色谱 很差,就不可能得到准确的定量结果。 (2)输入薄层扫描仪的参数不合理也会影响定量的 准确性,扫描方向应保持一致,应沿展开方向扫描, 不宜垂直于展开方向扫描。 总之,要得到理想的色谱分离及准确的定量结 果,色谱条件的标准化,操作技术的规范化是十分 重要的。 三、介绍CAMAG薄层扫描仪 1、基本原理 日本岛津生产的CS系列仪器 ? 瑞士CAMAG公司的薄层扫描仪 ? 基本原理:就是用一束长宽可以调节 的一定波长、一定强度的光照射到薄 层斑点上进行整个斑点的扫描,用仪 器测量通过斑点或被斑点反射的光束 强度的变化达到定量的目的。 ? 2、基本用途 (1)定性—光谱测定 在波长200-800nm之间进行斑点原位扫描,测得 该化合物的吸收曲线及最大吸收,并与对照品比较 从而对样品中该成分进一步确证。CAMAG公司的 WINCATS软件有斑点光谱图的储存功能,因此可对 斑点光谱进行检索,可随时与分析样品或标准进行 对比。 (2)定量—色谱测定,前面已经介绍了定量方法: 外标法、内标法等。 3、CAMAG薄层扫描的组成部分 (1)半自动点样仪: 注意:样品溶液应澄 清,防止溶液中的沉 淀堵塞点样针。 (2)数码照相系统 暗箱:可见光、254nm紫 外光、及365nm紫外光 光源。 注意:薄层照相前应挥 干溶剂,防止溶剂污染, 腐蚀仪器。 (3)薄层扫描仪 (1) 由光源、单色器、薄层板台、检测 器、WINCATS工作站组成。 (2)光源:钨灯:可见光区370-800nm 氘灯:紫外区190-450nm 汞灯:220-650nm 注意:(1)仪器使用过程中,当长时间不进 行扫描(约2小时),应把仪器内部的三个 光源灯(D2,W,Hg)通过手动控制面板熄 灭,或关闭仪器电源。 (2)仪器扫描结束后,应及时把薄层板取出, 避免溶剂蒸气进入仪器内部,污染光路部 件和腐蚀仪器。 4、维护 1、仪器工作环境:温度:18-35℃,相对湿度: 85%以下;要远离酸性、碱性或其他会引起 金属表面腐蚀的气体。 2、仪器使用后要马上清洁薄层板装载台,避 免溶剂或脱落的硅胶颗粒及残存试剂对仪 器的腐蚀。 3、仪器上盖不能摆放任何东西,包括纸张或 溶剂瓶子,避免影响仪器散热和防止溶剂 撒落到仪器表面和内部。 谢 谢

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